?

相關搜索:慢性腎炎 腎小球腎炎
您現在的位置:主頁 > 腎臟疾病 > 代謝性疾病的腎損害 > 高血壓腎病(良性高血壓腎小動脈硬化) > 相關文章 >
相關文章

王鋼論文《中國中西醫結合腎病雜志》LOX - 1 對食

來源:未知 作者:njboda 時間:2014-10-30 21:11

文獻出處:《中國中西醫結合腎病雜志》   2005 年10 月第6 卷

LOX - 1 對食鹽敏感性高血壓大鼠腎損害進展的影響及中藥干預作用

王鋼 仲昱 孔薇 劉麗 賈寧人 周恩超 鄒燕勤

〔摘 要〕 目的:圍繞內皮氧化低密度脂蛋白受體(LOX - 1) 與高血壓和腎損害的機制,從分子生物學方面探討中藥保腎片對LOX - 1 以及細胞增殖因子TGF - β、細胞外基質主要成分Ⅰ型膠原的影響。方法:對DS、DR 系大鼠半數予以高食鹽飲食,其余予對照飲食,另設高食鹽飲食+ 中藥保腎片高、低劑量2 組。4 周實驗結束后斷頭處死,切取腎臟,測定有關生化指標,并提取總RNA ,RT -PCR 處理制備探針,Northern blot 測定LOX -1 、TGF -β、Ⅰ型膠原的mRNA 表達。結果: (1) 服用8 %高食鹽的DS 大鼠主動脈及腎臟LOX-1 mRNA 表達顯著上調。(2) 高食鹽DS 大鼠LOX-1 升高同時可見TGF -β和Ⅰ型膠原mRNA 表達增加。(3)DS 高食鹽大鼠見到血壓升高,血膽固醇、甘油三酯升高,血肌酐升高,尿蛋白排泄增多。(4) 中藥保腎片與對照組相比,DS 8 %高食鹽大鼠的LOX-1 、TGF-β、Ⅰ型膠原的mRNA 表達顯著降低,血壓、血脂、血肌酐、尿蛋白亦見明顯下降。結論: (1)LOX- 1 在高血壓大鼠的主動脈上mRNA表達上調,可能與內皮依賴性血管舒張的損害有關。(2) 食鹽敏感性DS 大鼠的高血壓腎損害進展與LOX - 1 升高、多種細胞增殖因子及細胞外基質產生增加有關。(3) 保腎片可顯著降低LOX -1 的mRNA表達及TGF -β、Ⅰ型膠原的產生,降低血壓和蛋白尿,改善脂質水平和腎損害。中藥保腎片治療慢性腎衰竭、延緩高血壓腎損害進展的作用機制與降低腎臟中LOX -1 、TGF -β及Ⅰ型膠原的mRNA 表達有關。

〔關鍵詞〕 內皮氧化低密度脂蛋白受體 腎損害 保腎片 動物實驗

Effect of Baoshenpian Tablet on the Gene Expression of Oxidized Lowdensity Lipoprotein

Receptor and Cytokines in Experimental Hypertensive Glomerulosclerosis

WANG Gang , ZHONG Yu , KONG Wei , et al

Nephrology Center of Traditional Chi nese Medici ne , the Fi rst A f f liated Hospitalof N anji ng University of Traditional Chi nese Medici ne ,

N anji ng (210029)

  ABSTRACT Objective :To investigate the effect of the Chinese Herbal Medicine Baoshenpian tablet on oxidized low -

density lipoprotein receeptorl (LOX - 1) , transforming growth fator -β( TGF -β) ,type I collagen (Col Ⅰ) in Dahl salt - sen2sitive (DS) rats fed with high - salt (8 % NaCl) diet and the moleculobiological mechanism of LOX - 1 in hypertension andrenal damage. Methods :Two groups of rats were studied :DS rats and DR rats. Half of rats in each group were fed with high- salt diet ,the rest were fed with low - salt diet . Another two groups of DS rats with high - salt diet were given high or lowdose of Baoshenpian tablet . After 4 weeks of treatment ,kidneys were excised for extraction of RNA and preparing of probe byreverse - transcription - PCR. The LOX - 1 , TGF - βand Col ⅠmRNA expression was assessed by Northern blot analysiswhile some biochemical indices were observed. Results :LOX - 1 mRNA expression in the aorta was significantly elevated inhypertensive DS 8 % rats. The upregulation of LOX - 1 in DS8 % rats was accompanied by renal overexpression of TGF - βand Col Ⅰ,impaired renal function and elevated Bp and serum lipid ,all of which were ameliorated by Baoshenpian tablet .Conclusion :(1) The upregulation of LOX - 1 in the aorta of hypertensive rats may be related to the lesion of endothelium -derived vasodiatory effects. (2) The renal overexpression of LOX - 1 , growth factors and extracellular matrix proteins are re2sponsible for renal damage in hypertensive rats. (3) Chinese Herbal MedicineBaoshenpian tablet can downregulate the geneexpression of LOX - 1 ,TGF - βand Col and can decrease Bp ,serum lipid , urinary protein excretion and serum creatinine.The therapeutic mechanism of Baoshenpian tablet in delaying the progress of hypertensive renal damage may be relateditsdownregulation of the expression of LOX - 1 , TGF -βand Col Ⅰ.

KEY  WORDS  Oxidized low - density lipoprotein receptor1  Dahl salt - sensitive rats  Dahl salt - resistant rats  Baoshenpian tablet  Laboratory animals

  內皮氧化低密度脂蛋白受體1 (LOX -1) 是C型植物凝集素家族的一種膜蛋白,參與了動脈粥樣硬化和內皮依賴性血管舒張效應損傷的病理過程。近年來發現LOX - 1 在腎小球內皮細胞上和系膜細胞上也可表達。因此本實驗擬研究, (1) LOX - 1是否是導致腎小球硬化癥的一種調節因子; (2) 若LOX- 1 與腎小球硬化的進展有關,那么LOX - 1與已經明確的腎小球硬化的細胞增殖因子、細胞外基質成分關系如何; (3) 保腎片是全國著名中醫腎病專家鄒云翔教授治療慢性腎衰竭的經驗方,多年來在臨床運用取得明顯效果,保腎片延緩慢性腎衰竭進展的作用機制是否與調節LOX - 1 和多種細胞增殖因子及細胞外基質成分有關,我們進行了相關研究。

材料與方法

1  實驗材料

1.1  實驗動物 參照文獻選用食鹽敏感性(DS) 和食鹽抵抗性(DR) 大鼠,4 周齡,健康雄性,購自日本靜岡縣動物中心實驗室,平均體重(200 ±25) g。

1.2  實驗藥物 保腎片由連云港康緣制藥有限公司提供(批號:980403) ,每克浸膏含生藥7.2g ,參照成人日用量58 g/ 60 kg , 用蒸餾水配制成10.8g/ml 、5.4g/ ml 二種濃度混懸液。

1.3  主要試劑 DNA 隨機引物標記試劑盒(Promega) ;限制內切酶( Takara) mRNA 純化試劑盒( Pharmacia) ; Pfu 多聚( Stratagene) ; (α- 32 P)dCTP (Amersham) 。

1.4  實驗飼料和條件 8 %、0.3 % NaCl 大鼠顆粒飼料,隨意進食進水,室內濕度控制在60%~90 % ,溫度控制在16℃~22 ℃。

2  實驗分組 每個系的半數大鼠予以含8 %NaCl 的高鹽飲食,其余予0. 3 %NaCl 的低鹽對照飲食,另取2 組高食鹽DS 大鼠,分別灌服高低劑量保腎片,共喂養4 周。(1) DS 8 %高食鹽組: 雄性DS 大鼠7 只,予8 %NaCl 高食鹽飲食,喂養4 周。

(2) DR 8 %高食鹽組: 雄性DR 大鼠7 只,予8 %NaCl 高食鹽飲食,喂養4 周。(3) DS 0.3 %低食鹽組:雄性DS 大鼠7 只,予0.3 %NaCl 低食鹽飲食,喂養4 周。(4) DR 0.3 %低食鹽組:雄性DR 大鼠7 只,予0. 3 % NaCl 低食鹽飲食、喂養4 周。(5)DS8 %高食鹽+ 保腎片高劑量組:雄性DS 大鼠7 只,予8 %NaCl 高食鹽飲食。保腎片每日劑量43.3 g/ kg ,相當于人體用藥量42 倍,以10.8g/ml 保腎片混懸液每日2 次灌胃給藥,喂養4 周。(6) DS 8 %高食鹽+ 保腎片低劑量組:雄性DS 大鼠7 只,予8 %NaCl 高食鹽飲食。保腎片每日劑量10. 8 g/ kg ,相當于人體用藥量10.5 倍,以5.4 g/ml 的保腎片混懸液每日2 次灌胃給藥,喂養4 周。

3  檢測方法

3. 1  探針制備 用RT - PCR 合成大鼠LOX- 1的cDNA。PCR 引物: 5′- CTGGMTCTGGCAT2GRAGAAA - 3′和5′- YGCCTTCTTYTGACATATACTG- 3′。重復95 ℃變性1 min ,43 ℃退火1 min ,75 ℃延伸3 min ,共進行35 個循環,PCR 產物克隆到pBluescript Ⅱ上,并雙向測序。核

苷酸順序分析揭示該產物長361 bp ,與牛及人相應部位的LOX - 1 cDNA 分別有75.8 %及77.7 %的同源性,氨基酸順序含有121 個殘基,相應的與牛及人的LOX - 1 蛋白質分別有67.8 %與68.6 %的同源性,采用隨機引物標記法將(α- 32 P) dCTP 標記到探針上。

3. 2  RNA 制備 實驗結束時,大鼠斷頭處死,解剖主動脈、靜脈、肺和腎,立即置于液氮中冷凍, - 80 ℃下貯存備用,用酸化胍基硫氰酸鹽/ 氯仿方法提取總的RNA。用mRNA 純化試劑盒提取mRNA。

3. 3  Northern blot 分析 將DS、DR 大鼠主動脈、腎臟中提取的總RNA 20μg 在1. 2 %甲醛瓊脂凝膠電泳上分離,設GAPDH 為內對照,轉移到尼龍膜上,含50 %甲酰胺溶液中,42 ℃下與(α- 32P) 標記探

針雜交16 h 。室溫下膜在2 ×SSC、0.1 %SDS 沖洗2 次,在0. 1 ×SSC、0.1 % SDS 中于68 ℃沖洗1 h ,然后在下用加強熒光將濾膜曝光于Kodak Bio Max MS底片上或曝光于成像板上,進行掃描并用BAS 2000型生物圖像分析儀進行定量分析。

3.4  血壓、血脂及腎功能測定 實驗4 周結束時,采用夾尾方法測定大鼠血壓,眼眶后靜脈叢穿刺取血,測定血膽固醇、甘油三酯及血肌酐水平,代謝籠收集12 h 尿液測定尿蛋白排泄。

4  統計學方法 所有數據用(x-±s) 表示,采用SPSS 10. 0 統計軟件t 檢驗處理。

結  果

1  動物模型

1.1  一般表現 高食鹽組DS 大鼠表現出活動遲緩,倦怠乏力,毛聳稀疏,進食減少,生長緩慢等表現。低食鹽DS 大鼠和高食鹽組DR 大鼠一般表現基本正常。

1.2  LOX -1 的mRNA 表達 Northern blot分析DS 8 %高食鹽大鼠在4 周時主動脈和腎臟LOX - 1 mRNA 表達明顯升高( 與DR 8 %、DS0. 3 %和DR 0. 3 %組比較, P < 0. 01 ,P < 0. 05) 。見圖1 、表1 。

1.3  腎臟TGF - β和Ⅰ型膠原的mRNA 表達 DS 8 %高食鹽組腎臟的TGF - β和Ⅰ型膠原的mRNA 表達與DS 0. 3 %組比較均見到顯著的增高(P <0.01 , P < 0.05) 。見圖2 、表1 。

1.4  DS 和DR 大鼠血壓、血脂、尿蛋白及腎功能的變化 DS 高食鹽組大鼠實驗4 周時見到血壓、血脂、蛋白尿以及血肌酐升高,與DR 8 %、DS0. 3 %和DR 0.3 %組比較, 有統計學差異(P <0.05 , P < 0.01) 。見圖3~圖5 、表2 。

2  治療結果

2.1  保腎片對DS 8 %高食鹽大鼠腎臟LOX- 1mRNA 表達的影響 Northern blot 分析DS 8 %高食鹽大鼠加用保腎片高、低二組劑量治療4 周,與DS 8 %高食鹽組大鼠相比,腎臟LOX - 1 mRNA 均明顯下調( P < 0.01 , P <0.05) 。見圖6 、表1 。

2.2  保腎片對DS 8 %高食鹽大鼠腎臟TGF -β和Ⅰ型膠原mRNA 表達的影響 Northernblot 分析DS 8 %高食鹽大鼠同時加用保腎片高、低二組劑量治療4 周后, TGF -β和Ⅰ型膠原mRNA表達水平均明顯下降(P <0.01 , P <0.05) 。見圖7 、表1 。

2.3  保腎片對DR 和DS 大鼠血壓、血脂、尿蛋白及腎功能的影響 保腎片高、低二組劑量治療4 周后,血壓下降;膽固醇和甘油三酯降低;尿蛋白減少;腎功能損害恢復正常( P < 0.05 , P < 0.01) 。保腎片二組劑量相比,高劑量組尿蛋白明顯低于低劑量組( P < 0.05) 。見圖3~圖5 、表2 。

 各組主動脈和腎LOX - 1 、腎TGF -β、腎Ⅰ型膠原的mRNA 表達及保腎片的干預作用 (x- ±s)

組別

鼠數

主動脈LOX- 1

腎LOX - 1

腎TGF - β

腎Ⅰ型膠原

DS 8%

7

0.12±0.0017

0.052±0.015

0.98±0.21

1.05±0.17

DR 8%

7

0.0010±0.0004**

0.005±0.009**

0.49±0.12*

0.54±0.08*

DS 0.3%

7

0.0011±0.0009**

0.007±0.013*

0.39±0.14**

0.26±0.09**

DR 0.3%

7

0.0012±0.0006*

0.001±0.0004**

0.46±0.13*

0.27±0.10**

DS 8%+保腎片高劑量組

7

        -

0.010±0.007**

0.58±0.17*

0.61±0.11**

DS 8%+保腎片低劑量組

7

        -

0.040±0.011*

0.69±0.16*

0.85±0.14*

 注:與DS 8 %組比較, *P < 0.05 , **P < 0.01

 各組血壓、血脂、尿蛋白及血肌酐的變化和保腎片的干預作用 (x- ±s)

組別

鼠數

收縮壓(mmHg)

膽固醇

(mg/ dl)

甘油三酯

(mg/ dl)

尿蛋白

(mg/ dl)

血肌酐

(mg/ dl)

DS 8%

7

250±20

140±16

164±24

35±14

0.58±0.17

DR 8%

7

155±24**

63±9.1**

51±7.5**

2.6±0.6**

0.35±0.11*

DS 0.3%

7

145±25**

71±20**

137±14*

2.4±0.7**

0.45±0.14

DR 0.3%

7

130±15**

58±12**

72±10**

2.5±0.9**

0.48±0.19

DS 8%+保腎片高劑量組

7

150±11**   

80±11**

124±14*

7.5±2.3**

0.31±0.08*

DS 8%+保腎片低劑量組

7

225±25    

94±14*

160±18

14±3.2**

0.35±0.12*

 注:與DS 8 %組比較, *P < 0.05 , *P < 0.01 ;與DS 8 % + 保腎片低劑量組比較, P < 0.05

討  論

高血壓腎損害主要是指高血壓引起的腎臟硬化性改變[1] 。未經治療的高血壓患者可有42 %發展為腎臟硬化性損害,大約10 %死于腎衰竭。現代研究表明,血流動力學因素和脂代謝紊亂在其進展和惡化過程中起重要作用。LOX - 1 是氧化低密度脂蛋白的受體[2] ,在腎小球內皮細胞和系膜細胞上亦可見到其表達[3 ] ,參與了動脈粥樣硬化和內皮依賴性血管舒張效應損傷等病理損害。本次實驗中發現DS 高食鹽組大鼠的主動脈上和腎臟中LOX - 1 mRNA 表達明顯上調,血壓、血脂升高的同時,見到血膽固醇、甘油三酯升高,尿蛋白排泄增多,腎功能減退,血肌酐異常(見圖3~圖5) ,另4~8 周后腎臟的病理并出現細胞增殖和硬化,以及一些纖維素樣壞死[3] ,符合高血壓腎損害的臨床和病理特點。因此,本研究結果提示高食鹽可誘發DS大鼠腎臟損害,同時發現,LOX - 1 在腎臟的表達也明顯增高,回答了假設1 所提出的問題,即高血壓腎小動脈硬化與LOX - 1 的表達失衡有關。                                                                                                       -   對于LOX - 1 在DS 8 %高食鹽大鼠腎臟表達的上調,究其原因考慮: (1)與系統血壓有關。高食鹽DS 組大鼠血壓升高的同時LOX - 1 表達上調,結合我們以往的研究認為可能與內皮依賴性血管舒張效應減弱,加重高血壓有關,并能被降壓藥物所阻斷[4 ] 。( 2) 與高脂血癥有關。LOX -1 是Ox -LDL的受體,可在腎小球系膜細胞及內皮細胞上表達[3 ] ,并因Ox -LDL 的升高而上調。這種配體介導受體上調的負反饋抑制的喪失,可能是形成本病惡性循環, 不斷進展的重要原因。Ox -LDL/ LOX -1 系統不僅作用于動脈硬化,有可能參與了高血壓性腎小球硬化的過程。LOX -1 在腎臟的表達亢進,能進一步增加小球內壓[5 ] ,并通過系膜細胞過度攝取Ox -LDL ,產生與血管平滑肌相似反應,即系膜細胞增生和系膜基質產生過多,進入腎小球硬化的前期,除此以外,隨之而產生的黏附分子、生長因子及細胞因子等異常增加,損傷腎小球及間質,促進了腎臟硬化。

    一般認為,腎小球硬化癥的進展除了血流動力學因素及脂代謝紊亂外, TGF -β、PDGF 等等非血流動力學因子也與之有關。目前LOX - 1 活化的鏈級反應尚未完全闡明[3 ] 。Tat suya 等[6 ]發現某些炎癥因子可調節LOX -1 的表達。Ox -LDL 亦可誘導細胞因子和生長因子產生[7 ] 。目前TGF -β被認為是腎小球硬化的關鍵性因素,對細胞外基質的沉積和小球損害起主要作用[8 ] 。我們在實驗中發現高食鹽DS 大鼠LOX -1 升高同時, TGF -β和Ⅰ型膠原也增加(見圖1 、圖2) 。本研究結果說明了假設2 提出的問題:LOX -1 與TGF -β相互作用,增加內皮細胞和系膜細胞損害,細胞外基質的蓄積,促進了高血壓性腎小球硬化的進展。

    保腎片是著名中醫腎病專家鄒云翔教授治療慢性腎衰竭的經驗方,根據高血壓腎損害的主要病機腎虛濕瘀,治從補益腎元、和絡利濕泄濁入手,由何首烏、菟絲子、懷牛膝、澤瀉、制大黃組成。主要成分有蒽醌類衍生物,槲皮素,齊墩果酸,澤瀉醇(alisol) 等。可通過抑制腎小球系膜細胞DNA 和蛋白合成,抑制系膜細胞生長,誘導其發生凋亡,減慢殘余腎組織腎小球硬化的進展。此外還可選擇性抑制腎小管細胞的高代謝狀態,降低腎小管上皮細胞增殖,從而減輕健存腎單位的損害[911 ] 。以往的臨床研究表明保腎片能顯著延緩腎衰竭進展,減少進入尿毒癥人數,改善患者的臨床癥狀,近期有效率84.5 % ,5 年進入尿毒癥終末期的患者人數降為32.95 %( P < 0.05 , P < 0.01) [1] 。本次實驗發現,中藥保腎片可明顯減少DS 8 %高食鹽大鼠腎臟LOX - 1 mRNA 的表達(見圖6) ,下調DS 8 %高食鹽大鼠腎臟TGF-β和Ⅰ型膠原產生(見圖7) ,同時具有降低血壓,降低膽固醇、甘油三酯,減少蛋白尿作用(見圖3~圖5) 。本實驗結果回答了假設3提出的問題,即保腎片能保護腎功能,對腎臟LOX- 1mRNA表達的降低,以及下調細胞因子TGF -β和細胞外基質成分Ⅰ型膠原的mRNA 表達,降低血壓,改善血脂,是其腎保護作用的機制之一。

?

更多>>百年傳承 腎科世家

? 贵州十一选五下载