?

相關搜索:慢性腎炎 腎小球腎炎
您現在的位置:主頁 > 腎臟疾病 > 原發性腎臟病 > 慢性腎小球腎炎 > 學術文章 >
學術文章

王鋼論文《現代中西醫結合雜志》腎炎靈誘導大

來源:未知 作者:njboda 時間:2016-02-25 09:48

文獻出處《現代中西醫結合雜志》 2005 Sep, 14(18)

腎炎靈誘導大鼠腎系膜細胞凋亡的研究

劉 麗, 王 鋼, 倪 斌

( 江蘇省中醫院, 江蘇南京210029)

摘  要   目的  研究腎炎靈對大鼠系膜細胞凋亡的影響。方法 取SD 大鼠腎臟進行腎系膜細胞體外培養, 用腎炎靈喂服系膜增生性腎炎大鼠, 以含藥大鼠血清加入到體外培養的大鼠系膜細胞中, 應用倒置顯微鏡、光鏡、流式細胞儀等觀察、檢測腎炎靈對系膜細胞凋亡的影響。結果   喂服腎炎靈大鼠的血清可誘導部分系膜細胞發生凋亡。結論   腎炎靈的作用機制可能與其誘導腎系膜細胞發生凋亡有關。

關鍵詞 腎炎靈; 系膜細胞; 凋亡

中圖分類號 R- 33   文獻標識碼 A    文章編號1008-8849( 2005) 18-2379- 02

Study of mesangial cell apoptosis in rats induced by Shenyanling,LIU Li, WANG Gang, NI Bin

( Tradit ional Chinese Medical Hospital of Jiangsu Province, Nanjing 210029, Jiang su, China)

Abstract: Objective It is to study the influence of Sheny anling on the apoptosis of mesangial cell in r ats. Methods T he kidneys of SD rats were gotten to cultivate t he mesangial cells in vitro . The serum from rats with mesangial proliferative nephritis which had been given Shenyanling was added to the mesangial cells above. The influence o f Shenyanling on t he apoptosis o f mesang ial cell were observed and detect ed with inverse microscope, optical microscope and flow cytometr y. Results T he serum from rats g iven Shenyanling could induce apoptosis of some rat mesangial cells. Conclusion The mechanism of Shenyanling maybe cor relates to it inducing apoptosis of mesangial cells.

Key words: Shenyanling; mesangial cell; apoptosis

    中藥復方腎炎靈是本院經20 多年反復探索, 綜合中醫辨證辨病特點而研制的復方雷公藤制劑, 其對慢性原發性腎小球疾病、難治性腎病綜合征有確切的臨床療效, 且能明顯減輕患者的蛋白尿和血尿, 改善腎小管間質及腎功能損害[1- 2] 。本實驗擬研究腎炎靈對體外培養大鼠腎臟系膜細胞凋亡的影響, 從細胞水平進一步深入探討其作用機制。

1   材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物    遠交系健康雄性SD大鼠35只, 體質量(150±21) g, 由南京中醫藥大學實驗動物中心提供(實驗動物使用許可證號SYXK(蘇) 2001- 2010)。

1.1.2 藥物及主要試劑    腎炎靈浸膏(主要成分有雷公藤、蜀羊泉、生黃芪等) 由連云港康緣制藥有限公司生產, 批號010215。每克浸膏干粉合生藥9.4g , 成人日用量生藥0.75g/kg, 相當于腎炎靈片為0.08g/kg。RPMI 1640( GIBCO) 、胎牛血清(FCS, Hyclone) 、膠原酶IV型(Sigma)、MTT(Sigma)、胰蛋白酶(進口分裝) 、HEPES(B. M.) 等。

1.1.3 主要儀器     重慶XDS- 1B 倒置生物顯微鏡, LDZ5-2 離心機, DKB- 8A 型電熱恒溫水槽, SW- CJ- 1F 凈化工作臺, Forma 3111 CO2 培養箱, FACS Calibur 流式細胞儀等。

1.2 方法

1.1.1 含藥血清的制備    實驗大鼠經適應性喂養1 周后, 隨機分為正常組、模型組和腎炎靈劑量組, 每組10只。參照文獻[3] 制作系膜增生性腎炎大鼠模型。腎炎靈治療組自正式免疫第1 天開始給藥, 根據文獻[4]換算劑量, 腎炎靈劑量組每只大鼠每日用藥劑量0.44g/kg(合生藥4.14 g/kg) 。正常組灌服等量蒸餾水。全部大鼠于正式免疫8 周后分別經眼眶靜脈叢取血, 所取大鼠血液經3000 r/ min 離心10 min 取血清, 56℃水浴30 min滅活, 0.22µm 無菌濾器過濾除菌, 分裝,- 80℃保存備用。

1.2.2 細胞培養及鑒定     斷頭處死5只SD 大鼠, 快速取出腎臟, 無菌Hanks 緩沖液洗滌腎臟, 剝去腎包膜, 剪刀剪取腎皮質成小碎塊, 分別經80 目、150 目、200 目不銹鋼網篩過濾分離腎小球, IV型膠原酶37°C水浴消化, 間隔振搖約15 min。用不完全培養基離心洗滌后, 完全培養基懸浮腎小球, 接種于細胞培養瓶中, 鏡下觀察腎小球消化和密度情況, 37℃、5% CO2 靜止培養。結蛋白、角蛋白免疫熒光鑒定系膜細胞。傳代培養獲得大量細胞后進行實驗。

1.2.3 光鏡觀察      調細胞濃度為約166個/ mL, 取50~100µL 細胞懸液均勻涂布于載玻片上, 95%乙醇固定5 min, 滴加蘇木精染液, 室溫固定1 min, 用水輕洗去染液, 1%鹽酸酒精分化10 s, 流水沖洗, 晾干, 光學顯微鏡下觀察。

1.2.4 流式細胞儀檢測      0.25%胰酶消化系膜細胞, 調細胞密度為約1×105個/ mL, 細胞培養瓶中預培養48 h。待系膜細胞完全貼壁后, 棄舊培養基, 將細胞分成3組: 10%正常大鼠血清;10%模型組血清;10% 腎炎靈劑量組血清。每組分別用FCS 補足血清濃度至20%, 37℃ 、5% CO2 條件下分別培養24, 48 h。每組設3個平行實驗。培養結束后, 消化培養瓶內細胞, 1000r/min 離心5min, 棄上清液。PBS 工作液洗滌細胞2次, 調細胞密度為1×106個/mL, 將細胞懸浮于PI 低滲液中, 置4°C 染色約20min, 過濾, 流式細胞儀檢測細胞凋亡率。統計方法采用t 檢驗。

2   結 果

2.1 倒置顯微鏡觀察    含腎炎靈浸膏藥物的血清作用后, 系膜細胞收縮明顯, 間距增大, 胞質中顆粒物增多, 透明度降低,有部分細胞懸浮, 隨時間延長漂浮細胞逐漸增多。對照組細胞生長狀態良好, 透明度高, 細胞形態始終為梭形或星形等。

2.2 光鏡觀察    含藥血清組的細胞胞膜完整, 染色質凝聚,嗜堿性增強, 染成深藍色。對照組細胞形態正常。

2.3 流式細胞儀檢測     見表1。由表1 可知, 24h、48h 處理組細胞, 正常組與模型組的凋亡率無顯著性差異。處理24h,腎炎靈治療組與正常組、模型組凋亡差異不顯著; 處理48 h,腎炎靈治療組與正常組、模型組凋亡差異顯著, 凋亡峰見圖1。

表1 10%含藥血清對大鼠系膜細胞凋亡率的影響(x±s,%)

組別

24h凋亡率

48h凋亡率

正常組

0.250±0.236

2.893±0.519

模型組

0.110±0.072

3.470±0.588

腎炎靈組

1.640±1.457

5.663±0.640①②

注: ①與正常組比較, P<0.01; ②與模型組比較, P<0.05。

3 討 論

    系膜細胞是腎小球的固有細胞之一, 正常情況下腎小球系膜細胞僅行使收縮、吞噬及維持基質的正常代謝等功能。然而病理情況下系膜細胞能出現明顯的增殖, 以炎癥為主的腎小球疾病早期均伴有明顯的系膜細胞增殖。系膜細胞過度增殖, 一方面突入腎小球毛細血管腔, 導致管腔狹窄或閉塞;另一方面又可產生大量的細胞外基質, 促進腎小球硬化。因此, 若能有效地控制系膜細胞增殖, 則可減緩腎小球疾病的進一步惡化。

    本實驗腎炎靈劑量組血清由造模動物喂服中藥后而獲得, 這與一般的從喂服中藥的正常大鼠中獲取血清不同, 它是病理狀態下治療疾病后的血清, 其既內含中藥有效成分又可能內含疾病狀態下機體代謝的相關成分, 因此用造模后喂服中藥的血清做實驗更能反映藥物的治療機制。

 

圖1 流式細胞儀檢測( 示凋亡峰)

注: a. 24h 正常組; b. 24h 模型組; c. 24h 腎炎靈組;

d. 48h 正常組; e. 48h 模型組; f. 48h 腎炎靈組

中藥復方腎炎靈具有健脾益腎、益氣養陰、清熱利濕解毒、活血化瘀的功效。本實驗結果表明腎炎靈治療腎小球疾病的有效作用機制, 與其誘導腎系膜細胞發生凋亡有關。細胞凋亡是與細胞壞死有著本質區別的一種生理性調控機制,形態學上可見到細胞核染色質凝集、趨邊化, 細胞縮小等。凋亡與增殖是調控細胞數目穩態、作用相反的一對機制, 細胞凋亡與腎臟疾病的發生、發展及轉歸均密切相關[5] 。研究表明,系膜細胞的增生和細胞外基質的積聚是導致腎小球硬化的主要因素, 而細胞凋亡可使增生的腎小球系膜細胞數量恢復正常[6] 。因此, 誘導細胞凋亡將有利于清除過度增生的腎小球系膜細胞, 阻止腎小球硬化的進一步發展。

?

更多>>百年傳承 腎科世家

? 贵州十一选五下载